ارزیابی تأثیر تلقیح بذر با باکتری سودوموناس و کاربرد سطوح مختلف فسفر بر جذب عناصر، میزان کلروفیل و عملکرد زیستی دو رقم جو علوفه ای در منطقه فومن

مقدمه

فسفر پس از نیتروژن، مهم‌ترین عنصر مورد نیاز گیاهان و ریزجانداران بوده، و اصلی‌ترین نقش آن در فرایند تولید و انتقال انرژی است(Wagar et al., 2004). فسفر مورد نیاز گیاه عموماً از طریق استفاده از کودهای شیمیایی تأمین می‌شود (Whitelaw et al., 1999). با این‌وجود مقدار زیادی از فسفر موجود در کود‌های شیمیایی بعد از ورود به خاک، نامحلول یا کم‌محلول شده و در خاک‌های آهکی به ترکیب‌های نامحلول کلسیم و منیزیم، و در خاک‌های اسیدی به فسفات آهن و آلومینیوم تبدیل و از دسترس گیاه خارج می‌گردد. علاوه بر مصرف کودهای شیمیایی، یکی دیگر از روش‌های تأمین‌کننده فسفر مورد نیاز گیاهان، استفاده از منابع زیستی است (Moalem et al., 2008). کودهای زیستی در مقایسه با کودهای شیمیایی، مزیت‌های قابل‌توجهی دارند. به‌عنوان مثالعدم تولید مواد سمی و میکرب، قابلیت تکثیر خودبه‌خود، بهبود ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک از جمله این مزیت‌ها هستند (Moalem et al., 2008). این کودها از نظر اقتصادی مقرون به صرفه و از دیدگاه زیست‌محیطی قابل‌پذیرش می‌باشند. مصرف توأم کودهای شیمیایی و زیستی می‌تواند به افزایش راندمان جذب فسفر در گیاه کمک کند (Zabihi et al., 2009b).‌

ریزجانداران حل‌کننده فسفات به گروهی از ریزجانداران خاک‌زی اطلاق می‌گردد که به‌عنوان اجزاء مکمل چرخه فسفر قادرنداز طریق مکانیسم‌های مختلف، فسفر را از منابع نامحلول آزاد کنند (SalehRastin, 2004). باکتری‌هاو قارچ‌های حل‌کننده فسفات از جمله ریزموجودات مؤثر در این فرایند شناخته شده‌اند (Vazques et al., 2000). باکتری‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های تسهیل‌کننده جذب فسفات قادرند با مکانیسم‌هایی مانند تولید و ترشح اسیدهای آلی به‌ویژه 2_-کتواگزالیک، سیتریک و مالیک در حلالیت فسفات‌های معدنی کم‌محلول مؤثر باشند. به‌علاوه بسیاری از این باکتری‌ها با تولید آنزیم‌های فسفاتاز سبب آزاد شدن فسفر از ترکیب‌های آلی فسفردار می‌شوند. باکتری‌های حل‌کننده فسفات سبب کنترل زیستی‌پاتوژن‌های گیاهی (Weller and Thomashaw, 1994)، حلالیت عناصر غذایی (Rodriguez and Fraga, 1999) وسنتز هورمون‌های گیاهی (Gutierrez-Manero et al., 2001) نیز می‌شوند. باکتری‌های ریزوسفری افزایش‌دهنده‌رشد که بهباکتری_‌‌های ریزوسفری محرک رشد (Plant Growth Promoting Rhizobacteria)اطلاق می‌گردد،از جمله منابع زیستی حل‌کننده فسفات می‌باشند که از طریق مستقیم و غیرمستقیم باعث رشد گیاه می‌شوند (Khalid et al., 2006).PseudomonasوBacillus از مهم‌ترین انواع PGPR به‌شمار می‌روند (Tilak et al., 2006).باکتری‌های سودوموناس، پتانسیل قابل‌توجهی در بهبود کارآیی جذب فسفر از خود نشان داده و به‌علت وسعت انتشار، تنوع گونه‌ای و مقاوم بودن برخی از گونه‌های آن به تنش‌های محیطی توانسته‌اند به‌عنوان کود زیستی مناسب (Kim et al., 1989; Loheurte and Betrthlin, 1988)از جایگاه خاصی برخوردار گردند.

جو Hordeum vulgare L. یکی از مهم‌ترین غلات است که مصرف دومنظوره دارد. کشت جو با سابقه دیرینه هزاران‌ساله و انتخاب ژنوتیپ‌های سازگار به شرایط محیطی خاص طی ادوار گذشته از یک سو و جنبه‌های مختلف تغذیه آن از سوی دیگر باعث شده‌است که‌زراعت این گیاه‌ به‌عنوان محور اصلی سیستم‌های زراعی در دنیا ارزیابی گردد. در حال حاضر اهمیت جو در دنیا تقریباً برابر گندم بوده، لیکن تولید آن حدود نصف میزان تولید گندم است.غلات بیش‌ترین نیاز را به کودهای شیمیائی دارند؛ بنابراین استفاده از فرآورده‌های زیستی در جهت تغذیه آن‌ها یکی از راه‌حل‌های اساسی و مفید جهت افزایش عمل‌کرد و بهبود کیفیت محصول، تأمین امنیت غذائی، پایداری در تولید و ارتقاء سطح سلامت جامعه در تولید محصولات کشاورزی عاری از هرگونه سم و آفت‌کش به‌نظر می‌رسد.هدف این پژوهش بررسی تأثیر تلفیق باکتری حل‌کننده فسفات103P. fluarescensstrain و کاربرد کود حاوی فسفر بر عمل‌کرد و جذب عناصری هم‌چونفسفر در دو رقم جو علوفه‌ای (فصیح و بهمن) بود.

مواد و روش‌ها

این آزمایش در سال زراعی 89-1388در شهرستان فومن در استان گیلان با آرایش فاکتوریل و در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی در 3 تکرار به اجرا درآمد. فسفر در 5 سطح [تلقیح بذر باstrain 103Pseudomonas fluorescenceو100% کود شیمیایی حاوی فسفر، تلقیح بذر با باکتری و 75% کود شیمیایی دارای فسفر (75% از کل فسفری که باید به خاک داده شود)، تلقیح بذر با باکتری و 50% کود شیمیایی فسفردار(50% از کل فسفری که باید به خاک داده شود)، تلقیح بذر با باکتری و بدون استفاده ازکود شیمیایی حاوی فسفر، و تیمار بدون تلقیح بذر و بدون استفاده از کود شیمیایی فسفردار (شاهد)] و رقم در دو سطح بهمن و فصیح (این دو رقم در منطقه به‌میزان زیادی مورد کشت‌و‌کار قرار می‌گیرند) به‌ترتیببه‌عنوان عامل‌های اول و دومدر نظر گرفته شدند. عملیات آماده‌سازی زمین شامل شخم، دیسک و ماله به‌نحو مطلوب قبل از کاشت انجام شد.سپس از عمق 30 سانتی‌متری خاک محل اجرای آزمایش، نمونه‌گیری مرکب به‌عمل آمد، و میزان عناصر غذائی پرمصرف و کم‌مصرف خاک در بخش خاک‌شناسی مؤسسه تحقیقات برنج اندازه‌گیری شد (جدول 1).

جدول 1----------------

پس از ایجاد شیارها، نقشه آزمایش روی زمین پیاده گردید. هر کرت آزمایشی از 5 ردیف کاشت با تراکم 350 بوته در مترمربع تشکیل شد. فاصله بین کرت‌ها 5/0 متر و بین تکرارها 3 متر در نظر گرفته شد. قبل از کاشت، یک‌سومنیتروژن(از منبع اوره) به‌میزان200 کیلوگرم در هکتار و پتاسیم(از منبع سولفات پتاسیم)به‌مقدار 100 کیلوگرم در هکتاروفسفر(از منبع سوپرفسفات تریپل)با مقادیری متناسب باسطح فسفر موردنظر در تیمارها،به کرت‌های آزمایشی اضافه شدند. نیتروژن در دو نوبت دیگر نیز (شروع ساقه‌دهی و شروع گل‌دهی) به‌صورت سرک در اختیار گیاه فرار داده شد.

ریزجانداران (Microrganisms) حل‌کننده فسفات مورد نظر ابتدا در آزمایشگاه زیست‌شناسی مؤسسه تحقیقات خاک و آب فرموله و تهیه شدند. جمعیت باکتری‌های بومی خاک، 10⁷ × 6/4(جدول 2) و جمعیت باکتری‌ها در هر گرم مایه تلقیح، 10⁷ × 8/9 برآورد گردید. ماده حامل نیز پرلیت بود. برایکشتباکتری‌هاازمحیطکشت King B استفاده شد. 48 ساعت پسازکشتانفرادیباکتری‌ها،جمعیتآن‌هابه‌روش Plate Countو بر روی محیط‌های اختصاصی شمارش گردید. سپس حجم مساوی از آن‌ها با یک‌دیگر مخلوط شده و مجدداً جمعیت در محیطکشت،شمارشو مایه تلقیح آماده گردید.

جدول 2------------

در تیمارهایی که بایستی بذرها با این ریزجانداران تلقیح می‌شدند، پس از محاسبه میزان بذر برای هر تیمار و ریختن بذرهای جو در داخل یک کیسه پلی‌اتیلنی، مقدار 20 میلی‌لیتر محلول شکر 20 درصد به آن اضافه گردید. آن‌گاه کیسه حاوی بذر و ماده چسباننده برای مدت 30 ثانیه به شدت تکان داده شد تا سطح تمامی بذرها به‌طور یک‌نواخت چسبناک گردد. پس از آن، مقدار 20 گرم از مایه تلقیح به بذرهای چسبناک اضافه شد؛ و پس از 45 ثانیه تکان دادن و اطمینان از چسبیدن یک‌نواخت مایة تلقیح به آن‌ها، بذرهای آغشته به مایــه تلقیح بر روی ورقه آلومینیومی تمیز در زیر سایه پهن گــردید تا خشــک شدنــد (Somasegaran and Hoben, 1994). سپس به‌سرعت نسبت به کاشت بذرها اقدام شد. کاشت بذرها بر روی خط‌های کاشت در عمق 2 تا 3 سانتی‌متر انجام گرفت. پس از کاشت، بلافاصله آبیاری انجام شد.تمامی عملیات زراعی از قبیل تنک کردن و وجین به‌طور هم‌زمان و به‌نحو مطلوب انجام گردید.ارتفاع بوته، قطر ساقه، وزن خشک بوته (عمل‌کرد زیستی)،میزان کلروفیل‌هایa وb و میزان جذب عنصرهای فسفر و آهن درگیاه، از جمله ویژگی‌های مورد بررسی بودند. قبل از به خوشه رفتن گیاه، از 4 برگ انتهائی 4 بوته در هر تیمار نمونه‌برداری شد؛ و به‌مدت 48 ساعت در دمای 75 درجه سانتی‌گراد خشک گردید. سپس نمونه خشک‌شده، آسیاب شد. اندازه‌گیری فسفر(بر حسب میلی‌گرم بر دسی‌لیتر) در گیاه به‌روش کالری‌متری انجام گردید. در این روش ابتدا 2 میلی‌لیتر از محلول عصاره گیاهی را به بالن ژوژه 25 میلی‌لیتری منتقل کرده، 5 میلی‌لیتر از محلول آمونیوم مولیبدو وانادات به آن افزوده گردید و به حجم رسانده شد. پس از گذشت نیم‌ساعت، فسفرنمونه‌ها در طول موج 640 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید (Chapman and Part, 1961).میزان اندازه‌گیری عنصرآهن(میلی‌گرم بر دسی‌لیتر) در اندام هوایی گیاه، به‌روش خشک (Dry ashing)و ترکیب با اسید هیدروکلریک 2 نرمال به‌دست آمد (Chapman and Part, 1961).برای اندازه‌گیری ارتفاع بوته از خط‌کش مدرج استفاده و از ناحیه طوقه تا انتهائی‌ترین بخش ساقه اندازه‌گیری شد. میانگین ارتفاع 10 بوته به‌عنوان میانگین ارتفاع گیاه در آن تیمار در نظر گرفته شد. برای اندازه‌گیری قطر ساقه نیز از کولیس استفاده گردید. برای اندازه‌گیری کلروفیل، ابتدا برگ مشخصی در هر بوته، انتخاب و در ازت مایع پودر، و با10 سی‌سی استون 80% مخلوط گردید. سپس نمونه‌ها به‌مدت 48ساعت در یخچال قرار داده شدند. سرانجام،نمونه‌ها سانتری‌فوژو با اسپکتروفتومتر (در طول موج‌های 663 و 646 نانومتر) قرائت گردیدند. در پایان با استفاده از فرمول ذیل،میزان کلروفیل‌هایa و b(میلی‌گرم بر سانتی‌مترمربع) محاسبه شد (Loheurte and Betrthlin, 1988).

12.25 A_663.2- 2.79 A_646.2=کلروفیل a

=21.50 A_646.2-5.10 A_663.2کلروفیل b

در زمان برداشت،تمامی بوته‌های سبز در هر کرت از سطح خاک قطع گردیدند. سپس به‌مدت 48 ساعت در آون با حرارت 75 درجه سانتی‌گراد خشک و به‌عنوان عمل‌کرد زیستی توزین شدند.تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SAS وExcel انجام گرفت. برای مقایسه میانگین تیمارها نیز از آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد استفاده گردید.

نتایج و بحث

ارتفاع ساقه

نتایج تجزیه واریانس (جدول 2)، نشان داد که تأثیر رقم، کود و برهم‌کنش این دو عامل بر ارتفاع ساقه بسیار معنی‌دار (P<0.01)بود. مقایسه میانگین‌ها (شکل 1) حاکی از آن بود که بیشینه و کمینه ارتفاع ساقه به‌ترتیب از تیمار استفاده از 100% کود شیمیایی فسفردارو تلقیح با باکتری سودوموناس و تیمار شاهد به‌دست آمد. رقم‌های جو علوفه‌ای (فصیح و بهمن) از نظر ارتفاع ساقه اصلی در یک گروه آماری قرار گرفتند (جدول 3). رقم‌های مزبور با 100 درصد کود شیمیایی حاوی فسفر و تلقیح با باکتری سودوموناس بیش‌ترین و تیمار شاهد کم‌ترین ارتفاع ساقه را داشتند (جدول 4).به‌نظر می‌رسد که تلقیح میکربی باعث بهبود خصوصیات خاک،قابل‌دسترس بودن آب و عناصر ضروری گیاه از طریق افزایش تعداد گره‌ها و طول میان‌گره‌ها می‌شود؛ و ارتفاع گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهد (Brussard and Ferrera-Cenato, 1997).باکتری‌های حل‌کننده فسفات می‌توانند با سنتز هورمون‌های گیاهی باعث افزایش رشد گیاه شوند؛ به این ترتیب که مراحل اولیه رشد را تحت‌تأثیر قرار داده و ریشه، حجم بیش‌تری از خاک را اشغال می‌کند و سطح جذب گیاه افزایش می‌یابد (Arcon et al., 1976). در یک بررسی، ارتفاع بوته ذرت دورگ (واریته 704) تلقیح‌شده با آزوسپریلیوم افزایش یافت (Rousta et al., 1998).ارتفاع ذرت در اثر تلقیح بذر با باکتری سودوموناس حدود 5/8 درصد بیش‌تر شد (Zahir et al., 2002). افزایش ارتفاع ذرت در اثر تلقیح بذر با سودوموناس توسط دیگر محققان نیز گزارش شده است (Kapulnik et al., 1982).

شکل 1-2---------

جدول 3------------------4-5--------