1نویسنده مسئول، پژوهشگر، بخش تحقیقات زیست فناوری منابع طبیعی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران.
2دانشیار، بخش تحقیقات زیست فناوری منابع طبیعی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران
چکیده
سابقه و هدف: حفظ تنوع در سطوح ژنتیکی و بومسازگانی در برنامههای اصلاحی و ایجاد رقمهای جدید ضروری است. به همین علت، حفاظت از تنوع زیستی جنگلهای هیرکانی بهعنوان فسیل زنده، اهمیت ویژهای دارد. حفاظت فراسرد (Cryopreservation)، ذخیرهسازی نمونههای زیستی در مخازن پر از نیتروژن مایع است که مؤثرترین روش حفظ بلندمدت منابع ژنتیکی گیاهی محسوب میشود. این روش، جایگزینی برای بانکهای بذر یا در شرایط آزمایشگاهی است که میتواند هم برای محصولات تکثیرشده بهصورت رویشی و هم بهصورت زایشی (از طریق بذر) استفاده شود. دمای بسیار پائین، سلولها را در همان وضعیتی که هستند تثبیت کرده و امکان نگهداری بلند مدت آنها را میسر میسازد. روش نگهداری در دمای فراسرد در مقایسه با روشهای کلاسیک، نیاز به هزینه بسیار کم داشته و از طرفی مدت حفاظت نمونهها بسیار طولانی میباشد .در این روش، از قسمتهای مختلف گیاه (بذر، اندام، کالوس، سلولهای تمایز یافته، مریستم و دانه گرده) میتوان برای نگهداری استفاده نمود. در روش فراسرد، نمونهها در مقابل خطرات ناشی از آفات و بیماریها مصون مانده و برای نگهداری و محافظت گونهها، حداقل انرژی و فضا لازم است. علاوه بر اینکه، امکان تکرار نمونهها با حداقل هزینه و امکانات، در هر شرایط محیطی وجود دارد. در روش نگهداری فراسرد، امکان جمعآوری و ذخیرهسازی گونههای گیاهی اقلیمهای مختلف در یک مکان و شرایط واحد میسر میباشد. هدف پژوهش پیشرو، ارزیابی امکان نگهداری بذر شیردار (.Acer cappadocicum Gled) در شرایط فراسرد است. مواد و روشها: برای نگهداری بذرهای شیردار در فراسرد ابتدا توسط اعمال تیمارهای مختلف، بهمنظور جلوگیری از کریستاله شدن آب آزاد و پاره شدن غشا پلاسمایی در دمای فراسرد، آبگیری بذرها صورت گرفت. بههمین منظور بذرها در معرض تیمارهای شیمیایی و فیزیکی فراسرد پیش از ورود به نیتروژن مایع، قرار گرفتند. تیمارهای شیمیایی شامل، گلیسرول 30 درصد، محلول شیشهای شدن و تیمار فیزیکی کاهش رطوبت بذر بوسیله دسیکاتور حاوی سیلیکاژل می باشد. برای اینکه تحمل به کمآبی و فرایندهای کرایوژنیک به اندازه کافی افزایش پیدا کند. بذرهای تیمارشده به همراه بذرهای شاهد، پس از 24 ساعت از نیتروژن مایع خارج شدند و بلافاصله در دمای 42 درجه سانتیگراد ذوب شدند. سپس، بهمنظور شکستن خواب، بذرهای تیمارشده، بههمراه بذرهای شاهدی که در درون نیتروژن مایع قرار گرفته بود و بذر شاهدی که در درون نیتروژن مایع قرار نگرفته بودند، در ماسه مرطوب کاشته شدند و در دمای چهار درجه سانتیگراد قرار گرفتند. بذرها پس از سه ماه شروع به جوانهزدن کردند. سپس، زندهمانی و جوانهزنی آنها بررسی شد. در این پژوهش، هر تیمار شامل سه تکرار و هر تکرار شامل 25 بذر بود. برای تجزیه و تحلیل دادهها، تجزیه واریانس یکطرفه در قالب طرح پایه کامل تصادفی و مقایسه میانگینها بهروش چنددامنهای دانکن انجام گرفت. نتایج: در بین تیمارهای فراسرد اعمالشده روی بذرهای شیردار، تیمار آبگیری فیزیکی، بیشترین درصد جوانهزنی (26 درصد) و شاخص بنیه بذر را نسبت به تیمارهای دیگر در سطح اطمینان 99 درصد نشان داد، اما دو تیمار گلیسرول 30 درصد و شیشهای شدن سبب کاهش درصد جوانهزنی شیردار شدند. احتمال دارد که این گونه به مواد حفاظت فراسرد حساس باشد و این مواد به جنین بذر آسیب زده باشند. ازنظر ریختشناسی نیز بین تیمارها، تفاوت معنیداری در سطح اطمینان 95 درصد در طول ریشه، طول ساقه، طول گیاهچه و نسبت طول ریشه به طول ساقه وجود داشت. نتیجهگیری کلی: در این پژوهش، بذرهای سه اکسشن گونه شیردار جمعآوریشده از مناطق مختلف استان مازندران (ساری، دهمیان و کلیج کلا) تحت بهترین تیمار آبگیری فیزیکی قرار گرفتند. سپس، آنها در تانک مخصوص ذخیره نیتروژن مایع موجود در بخش تحقیقات زیستفناوری منابع طبیعی در مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور ذخیره شدند تا با استفاده از این فناوری، امکان احیا و حفاظت این گونه در شرایط بحرانی فراهم شود.
Preservation of the genome of Acer cappadocicum Gled. in cryopreservation
نویسندگان [English]
L. Mirjani1؛ A. Ghamari Zare2
1Corresponding author, Researcher, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran
2Associate Prof., Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran
چکیده [English]
Background and objectives: Protecting genetic and ecosystem diversity is essential for breeding programs and the development of new cultivars. The preservation of biodiversity in the Hyrcanian forests, often regarded as a living fossil, is particularly crucial. Cryopreservation, which involves storing biological samples in tanks filled with liquid nitrogen (LN), is the most effective long-term preservation method for plant genetic resources. It serves as an alternative to seed or in vitro banks and can be applied to both vegetatively and generatively propagated crops. Extremely low temperatures stabilize cells in their current state, allowing for long-term storage. This method incurs significantly lower costs compared to classical preservation techniques, while also offering extended sample protection. Various parts of the plant—including seeds, organs, callus, differentiated cells, meristem, and pollen—can be stored using cryopreservation. This technique protects samples from pests and diseases while requiring minimal energy and space for storage. Additionally, it allows for the replication of samples at low cost and with minimal facilities under any environmental conditions. Cryopreservation enables the collection and storage of plant species from diverse climates in one location under uniform conditions. This study aims to evaluate the feasibility of storing Acer cappadocicum Gled. seeds under cryopreservation conditions. Methodology: To store A. cappadocicum seeds in LN, they undergo various treatments to prevent the crystallization of free water and rupture of the plasma membrane at cryopreservation temperatures. The seeds were subjected to chemical treatments—30% glycerol and a vitrification solution—along with a physical treatment to reduce seed moisture using a desiccator containing silica gel. These treatments aimed to enhance tolerance to drought and cryogenic processes. After 24 hours in liquid nitrogen, the treated seeds, along with control seeds, were thawed immediately at 42 degrees Celsius. To break dormancy, all seeds—including treated seeds, control seeds that had been cryopreserved, and control seeds that had not been exposed to liquid nitrogen—were planted in moist sand at a temperature of four degrees Celsius. Germination began after three months, followed by assessments of viability and germination rates. Each treatment included three replications with 25 seeds per replication. Data analysis was conducted using one-way ANOVA within a completely randomized design, with means compared using Duncan's multiple range test. Results: Among the cryopreservation treatments applied to the seeds, physical dehydration yielded the highest germination percentage (26%) and seed vigor index compared to other treatments. Conversely, treatments with 30% glycerol and vitrification reduced germination rates for A. cappadocicum, suggesting sensitivity to these cryopreservatives that may harm the seed embryo. A significant difference was observed in root length and root-to-stem ratio among treatments; however, no significant differences were found in seedling length or stem length at the five percent level. Conclusion: In this research, seeds from three accessions of A. cappadocicum collected from different regions (Sari, Dehmian, and Kelich Kola) in Mazandaran province of Iran underwent physical dehydration treatment before being stored in LN tanks at the Research Institute of Forests and Rangelands in Tehran, Iran. This technology provides a viable method for conserving and protecting this species under critical conditions.