اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات286
تعداد نشریات سازمان84
تعداد شماره‌ها2,829
تعداد مقالات32,098
تعداد مشاهده مقاله40,864,085
تعداد دریافت فایل اصل مقاله18,113,701
Taghavi, M, Parham, A, Dehghani, H, Naderi-Meshkin, H. (1400). Optimizing Lipofectamine LTX Complex and G-418 Concentration for Improvement of Transfection Efficiency in Human Mesenchymal Stem Cells. سامانه مدیریت نشریات علمی, 76(5), 1315-1325. doi: 10.22092/ari.2021.354659.1645
M Taghavi; A Parham; H Dehghani; H Naderi-Meshkin. "Optimizing Lipofectamine LTX Complex and G-418 Concentration for Improvement of Transfection Efficiency in Human Mesenchymal Stem Cells". سامانه مدیریت نشریات علمی, 76, 5, 1400, 1315-1325. doi: 10.22092/ari.2021.354659.1645
Taghavi, M, Parham, A, Dehghani, H, Naderi-Meshkin, H. (1400). 'Optimizing Lipofectamine LTX Complex and G-418 Concentration for Improvement of Transfection Efficiency in Human Mesenchymal Stem Cells', سامانه مدیریت نشریات علمی, 76(5), pp. 1315-1325. doi: 10.22092/ari.2021.354659.1645
Taghavi, M, Parham, A, Dehghani, H, Naderi-Meshkin, H. Optimizing Lipofectamine LTX Complex and G-418 Concentration for Improvement of Transfection Efficiency in Human Mesenchymal Stem Cells. سامانه مدیریت نشریات علمی, 1400; 76(5): 1315-1325. doi: 10.22092/ari.2021.354659.1645

Optimizing Lipofectamine LTX Complex and G-418 Concentration for Improvement of Transfection Efficiency in Human Mesenchymal Stem Cells

Archives of Razi Institute
مقاله 20، دوره 76، شماره 5، بهمن و اسفند 2021، صفحه 1315-1325    اصل مقاله (755.44 K)
نوع مقاله: Original Articles
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22092/ari.2021.354659.1645
نویسندگان
M Taghavi1؛ A Parham* 1، 2؛ H Dehghani1، 2، 3؛ H Naderi-Meshkin4، 5
1Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2Stem Cell Biology and Regenerative Medicine Research Group, Research Institute of Biotechnology, Ferdowsi University of Mashhad, Azadi Square, Mashhad, 91779-48974, Iran
3Division of Biotechnology, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
4Stem Cells and Regenerative Medicine Research Group, Iranian Academic Center for Education, Culture, and Research (ACECR), Khorasan Razavi Branch, Mashhad, Iran
5Welcome-Wolfson Institute for Experimental Medicine, Queen's University Belfast, Belfast, UK
چکیده
Conventional cancer therapies, including surgery, radiotherapy, and chemotherapy, are not tumor site-specific and have cytotoxic and harmful side effects for normal cells. Mesenchymal stem cells (MSCs), due to their tumor-tropism migration property, are a promising alternative to deliver and produce antitumor agents. However, MSCs are difficult-to-transfect cells, and introducing the exogenous therapeutic gene into MSCs is challenging yet needs improvement. Transfection using chemical reagents, including Lipofectamine, is more convenient and less cytotoxic compared with different methods of introducing exogenous DNA into MSCs. Nonetheless, the major limitation of Lipofectamine is low transfection efficiency in MSCs. Therefore, the purpose of this study was to evaluate and suggest the optimum quantities of lipoplex components to enhance the transfection efficiency of human adipose tissue-derived MSCs (hASCs). Finding the best transgene expression time point and the optimum concentration of G-418 for antibiotic-based selection was another goal of this study. hASCs were transfected in a series of experiments with altering the quantities of Lipofectamine LTX® (Lip-LTX), the related “PLUS” reagent, and a plasmid DNA (pDNA) expressing the enhanced green fluorescent protein (eGFP). After transfection, the percentage of eGFP-expressing cells was evaluated using fluorescence microscopy and ImageJ software in 12-hour intervals for 48 hours. Also, the viability of hASCs exposed to different concentrations of G-418 was measured using an MTT assay. The results demonstrated that a combination of 2 µL Lip-LTX, 0.75 µL of its “PLUS” reagent, and 0.75 g pDNA (6484 bp) improve the transfection efficiency of hASCs (23.75%), and the best period for evaluation of fluorescence for these cells is 12 to 24h post-transfection. Also, the optimum concentration of G-418 for antibiotic-based selection of hASCs was 0.25mg/mL. In conclusion, this study indicates that the setting up of optimized quantities of lipoplex components and the golden time of evaluation for transgene expression could increase the possibility of transgene expression in hASCs before beginning research and clinical application. Also, the definition of optimal dose of selection antibiotic for purification of transfected hASCs seems to be necessary for maximum transgene expression effects in the cell population.
کلیدواژه‌ها
Genetic engineering؛ Mesenchymal stem cells؛ Transfection؛ Lipofectamine LTX
عنوان مقاله [English]
بهینه سازی کمپلکس لیپوفکتامین LTX و غلظت G-418 به منظور بهبود کارایی انتقال ژن به سلول های بنیادی مزانشیمی انسان
چکیده [English]
روش های متداول برای درمان سرطان، از جمله جراحی ، پرتودرمانی و شیمی درمانی، به صورت اختصاصی بر سلول های توموری اثر نمی‌گذارند و برای سلول های طبیعی بدن عوارض جانبی مهلکی دارند. سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs) به دلیل گرایش ذاتی در مهاجرت به سمت بافت تومور، گزینه ای امیدوارکننده برای تحویل عوامل ضد توموری و یا تولید آن ها در موضع اختصاصی تومور هستند. با این حال، انتقال ژن های خارجی به داخل سلول های بنیادی مزانشیمی امری چالش برانگیز است، چرا که سلول هایی سرسخت در پذیرش ژن خارجی هستند. بنابراین ورود ژن به داخل این سلول ها نیاز به بهینه سازی دارد. انتقال ژن با استفاده از مواد شیمیایی از جمله لیپوفکتامین، در مقایسه با سایر روش‌ها راحت تر انجام می شود و سمیت سلولی کمتری دارد. با این حال، محدودیت اصلی در استفاده از لیپوفکتامین، پایین بودن کارایی انتقال ژن است. هدف این مطالعه ارزیابی و پیشنهاد مقادیر مطلوب اجزای لیپوپلکس (مجموعه لیپوفکتامین، بافر و DNA) برای افزایش کارایی انتقال ژن به سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی انسان (hASCs) بود. یافتن زمان بیان مطلوب ژن خارجی و غلظت مطلوب آنتی بیوتیک G-418 نیز از اهداف دیگر این مطالعه بود. پس از انتقال ژن، درصد سلول‌های بیان کننده eGFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و نرم افزار ImageJ در فواصل 12 ساعته به مدت 48 ساعت ارزیابی شد. همچنین میزان زنده‌مانی hASCs در مواجهه با غلظت‌های مختلف آنتی بیوتیک G-418 با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که ترکیبی از 2 میکرولیتر لیپوفکتامین LTX به همراه 0.75 میکرولیتر بافر آن ("PLUS") و 0.75 میکروگرم از DNA پلاسمیدی باعث بهبود کارایی انتقال ژن به hASCs به میزان 23.75٪ می‌شود. بهترین بازه زمانی برای ارزیابی بیان پروتئین فلئورسنت در این سلول ها، بین 12 تا 24 ساعت پس از انتقال ژن بود. همچنین، غلظت مطلوب آنتی‌بیوتیک G-418 معادل 0.25 میلی گرم در میلی لیتر بود. در مجموع، نتایج این مطالعه نشان داد که احتمال بیان ژن خارجی با هدف درمانی در hASCs به مقدار بهینه شده اجزای لیپوپلکس و بازه زمانی طلایی برای ارزیابی وضعیت بیان آن ژن بستگی دارد.
کلیدواژه‌ها [English]
مهندسی ژنتیک, سلول‌های بنیادی مزانشیمی, انتقال ژن, لیپوفکتامین LTX
سایر فایل های مرتبط با مقاله
مراجع
  1. Hulvat MC. Cancer Incidence and Trends. Surg Clin North Am. 2020;100(3):469-81.
  2. Saadat S, Yousefifard M, Asady H, Moghadas Jafari A, Fayaz M, Hosseini M. The Most Important Causes of Death in Iranian Population; a Retrospective Cohort Study. Emerg .2015;3(1):16-21.
  3. Bagher F, Ghazale G, Ahad A. Incidence and Mortality of Various Cancers in Iran and Compare to Other Countries: A Review Article. Iran J Public Health. 2018;47(3).
  4. Abbas Z, Rehman S. An overview of cancer treatment modalities. J Neoplasm. 2018;1:139-57.
  5. Stuckey DW, Shah K. Stem cell-based therapies for cancer treatment: separating hope from hype. Nat Rev Cancer. 2014;14(10):683-91.
  6. Satija NK, Singh VK, Verma YK, Gupta P, Sharma S, Afrin F, et al. Mesenchymal stem cell-based therapy: a new paradigm in regenerative medicine. J Cell Mol Med. 2009;13(11-12):4385-402.
  7. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143-7.
  8. Shi Y, Hu G, Su J, Li W, Chen Q, Shou P, et al. Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression and tissue repair. Cell Res. 2010;20(5):510-8.
  9. González-Villarreal C, Guadalupe Martínez-Rodríguez H, Said-Fernández S. How desirable and undesirable features of naïve or genetically reengineered mesenchymal stem cells are being considered in preclinical or clinical assays. J BUON. 2017;22(4):812-30.
  10. Kelly AM, Plautz SA, Zempleni J, Pannier AK. Glucocorticoid Cell Priming Enhances Transfection Outcomes in Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Ther. 2016;24(2):331-41.
  11. Santos JL, Pandita D, Rodrigues J, Pego AP, Granja PL, Tomas H. Non-viral gene delivery to mesenchymal stem cells: methods, strategies and application in bone tissue engineering and regeneration. Curr Gene Ther. 2011;11(1):46-57.
  12. Hamann A, Nguyen A, Pannier AK. Nucleic acid delivery to mesenchymal stem cells: a review of nonviral methods and applications. J Biol Eng. 2019;13:7.
  13. Wang W, Xu X, Li Z, Lendlein A, Ma N. Genetic engineering of mesenchymal stem cells by non-viral gene delivery. Clin Hemorheol Microcirc. 2014;58(1):19-48.
  14. Madeira C, Mendes RD, Ribeiro SC, Boura JS, Aires-Barros MR, da Silva CL, et al. Nonviral gene delivery to mesenchymal stem cells using cationic liposomes for gene and cell therapy. J Biomed Biotechnol. 2010;2010:735349.
  15. Carter M, Shieh J. Chapter 11 - Gene Delivery Strategies. In: Carter M, Shieh J, editors. Guide to Research Techniques in Neuroscience (Second Edition). San Diego: Academic Press; 2015. p. 239-52.
  16. Gonzalez Villarreal C, Said Fernandez S, Soto Dominguez A, Padilla Rivas G, Garza Treviño E, Rodriguez Rocha H, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells: improving transgene expression level, transfection efficiency and cell viability. J BUON. 2018;23(6):1893-903.
  17. Naderi-Meshkin H, Matin MM, Heirani-Tabasi A, Mirahmadi M, Irfan-Maqsood M, Edalatmanesh MA, et al. Injectable hydrogel delivery plus preconditioning of mesenchymal stem cells: exploitation of SDF-1/CXCR4 axis toward enhancing the efficacy of stem cells' homing. Cell Biol Int. 2016;40(7):730-41.
  18. Delrue I, Pan Q, Baczmanska AK, Callens BW, Verdoodt LLM. Determination of the Selection Capacity of Antibiotics for Gene Selection. Biotechnol J. 2018;13(8):e1700747.
  19. Horizon. Dose response curve for antibiotic selection of mammalian cells 2015. Availablefrom:https://horizondiscovery.com/media/Files/Horizon/resources/Protocols/antibiotic-kill-curve-protocol.pdf.
  20. Ribeiro S, Mairhofer J, Madeira C, Diogo MM, Lobato da Silva C, Monteiro G, et al. Plasmid DNA size does affect nonviral gene delivery efficiency in stem cells. Cell Reprogram. 2012;14(2):130-7.
  21. Fiume G, Di Rienzo C, Marchetti L, Pozzi D, Caracciolo G, Cardarelli F. Single-cell real-time imaging of transgene expression upon lipofection. Biochem Biophys Res Commun. 2016;474(1):8-14.
  22. Locatelli P, Olea FD, Hnatiuk A, Sepulveda D, Perez Saez JM, Arguello R, et al. Efficient plasmid-mediated gene transfection of ovine bone marrow mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2013;15(2):163-70.
  23. Diaz P, Cuevas F, Peralta OA. GFP labelling and epigenetic enzyme expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bovine foetuses. Res Vet Sci. 2015;99:120-8.
  24. Daneshvar N, Rasedee A, Mehrbod P, Hashem Boroojerdi M. Optimizing Transfection of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Utilizing Minicircle plasmid/Lipofectamine LTX Complex. Appl Biotechnol Rep. 2014;1(3):111-6.
  1. Bruter AV, Kandarakov OF, Belyavsky AV. Persistence of plasmid-mediated expression of transgenes in human mesenchymal stem cells depends primarily on CpG levels of both vector and transgene. J Gene Med. 2018;20(2-3):e3009.
  2. Florian M, Wang JP, Deng Y, Souza-Moreira L, Stewart DJ, Mei SHJ. Gene engineered mesenchymal stem cells: greater transgene expression and efficacy with minicircle vs. plasmid DNA vectors in a mouse model of acute lung injury. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):184.
  3. Tsai HE, Liu LF, Dusting GJ, Weng WT, Chen SC, Kung ML, et al. Pro-opiomelanocortin gene delivery suppresses the growth of established Lewis lung carcinoma through a melanocortin-1 receptor-independent pathway. J Gene Med. 2012;14(1):44-53.
  4. Altanerova V, Cihova M, Babic M, Rychly B, Ondicova K, Mravec B, et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells expressing yeast cytosinedeaminase::uracil phosphoribosyltransferase inhibit intracerebral rat glioblastoma. Int J Cancer. 2012;130(10):2455-63.
  5. Bobis-Wozowicz S, Miekus K, Wybieralska E, Jarocha D, Zawisz A, Madeja Z, et al. Genetically modified adipose tissue-derived mesenchymal stem cells overexpressing CXCR4 display increased motility, invasiveness, and homing to bone marrow of NOD/SCID mice. Exp Hematol. 2011;39(6):686-96 e4.
  6. Kucerova L, Matuskova M, Pastorakova A, Tyciakova S, Jakubikova J, Bohovic R, et al. Cytosine deaminase expressing human mesenchymal stem cells mediated tumour regression in melanoma bearing mice. J Gene Med. 2008;10(10):1071-82.
  7. Tyciakova S, Matuskova M, Bohovic R, Polakova K, Toro L, Skolekova S, et al. Genetically engineered mesenchymal stromal cells producing TNFalpha have tumour suppressing effect on human melanoma xenograft. J Gene Med. 2015;17(1-2):54-67.
  8. Mortensen R, Chestnut JD, Hoeffler JP, Kingston RE. Selection of transfected mammalian cells. Curr Protoc Neurosci. 2001;Chapter 4:Unit 4 6.
  9. Mortensen RM, Kingston RE. Selection of transfected mammalian cells. Curr Protoc Mol Biol. 2009;Chapter 9:Unit95.
آمار
تعداد مشاهده مقاله: 1,974
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 916


counter
سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب