اثرات همزیستی میکوریزا بر برخی ویژگی های فیزیولوژیکی سسبانیا درتنش کم آبی

مقدمه:

کم آبی، امروزه یکی از مهمترین عوامل محدود کننده تولید محصول در نواحی خشک و نیمه خشک می باشد و کاهش رشد در اثر تنش خشکی به مراتب بیشتر از سایر تنش های محیطی است (2006 Rodringuez,). این تنش  می تواند تولید محصولات کشاورزی را حتی به نصف برساند (1980 ,  Larcher). امروزه تقریبا 70 درصد آب  کره زمین به مصرف کشاورزی می رسد و 40 درصد غذای مردم جهان نیز در زمین های کشاورزی تولید می شود . (Somerville, 2001) ایران نیز از نظر منابع و عوامل تولید کشاورزی از وضعیت خاصی برخوردار است. بدین معنی که از 165 میلیون هکتار مساحت کل کشور، تنها حدود 37 میلیون  هکتار اراضی مناسب کشت و زرع، می باشد.در حال حاضربه علت محدودیت آب فقط 8/7 میلیون هکتار از این اراضی به صورت فاریاب ،6 میلیون هکتار دیم و 5/4 میلیون هکتار دیگر نیز به صورت آیش استفاده می شود (کشاورز و صادق زاده، 1379). بنابراین یکی از مساﺋل مهم و جدی زیست بوم های کشاورزی و طبیعی ، تنش خشکی است.گیاه سسبانیا اکولیتا، از خانواده لگوم ها بوده وتثبیت نیتروژن بالای این گیاه در خاک سبب شده است که در تقویت زمین های زراعی مورد استفاده قرار گیرند. این گیاه نسبت به بسیاری از گونه های لگوم ، مقاومت زیادی به خشکی دارد و دوران بی آبی را تحمل می کند، بنابراین در کویرزدایی از این گیاه می توان استفاده کرد (Iram,2005).  اثرات کمبود آب در چندین لگوم مانند یونجه(Becana et al ,1986) و لوبیا (Guerin et al, 1991) نشان داد که تنش خشکی تغییراتی در فرآیندهای فیزیولوژی وبیوشیمیایی گرهک های تثبیت کننده ازت ایجاد می نماید و توانایی گرهک زایی و تثبیت نیتروژن را کاهش می دهد(Sperent, 1981). قارچ آربوسکولار میکوریزا بخش کلیدی میکروبهای خاک بوده و همزیست اجباری ریشه گیاهان می باشند. آنها در بهبود رشد و تغذیه معدنی گیاه به خصوص جذب فسفر نقش مهمی دارند (توسلی، 1379). قابلیت جذب فسفر، نیاز گیاه را جهت دریافت فسفر خارجی مرتفع می سازد. فسفر زیاد در خاک باعث آلودگی آب و فرسایش خاک شده و بدین گونه میکوریزا در کشاورزی اهمیت زیست محیطی دارد. یکی از مهمترین نقش های قارچ میکوریزا افزایش عملکرد گیاهان زراعی خصوصاً در خاک هایی با حاصلخیزی پایین می باشد که به دلیل افزایش سطح جذب ریشه ها از طریق  میسلیوم قارچ در خاک ایجاد می شود(1996 ،  Ortas). همزیستی میکوریزایی نه تنها جذب فسفر، ازت و پتاسیم را افزایش می دهد بلکه میزان گره زایی و تثبیت ازت را هم بهبود می بخشد(1999 ، Bowen ). و می تواند به عنوان یک عامل محافظت کننده خاک نیز باشد (مستاجران ، 1378). به طور کلی تلقیح خاک با Glomus intraradices، فیزیولوژی ریشه میکوریزی گیاهان به ویژه سنتز گلوتامین سنتاز(GS)، آرژینیناز و فعالیت اوره آز را تحت تاثیرقرار می دهد. آرژینیناز و اوره آز دو آنزیم کلیدی در انتقال نیتروژن از میسیلیوم به ریشه گیاه همزیست با میکوریزا هستند ( Bagoet et al 2001;Cruze et al,2007) . تحقیق حاضر به منظور بررسی اثرات قارچ میکوریز، بر جذب عناصر غذایی نظیر فسفر و ازت، فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز ،غلظت پرولین ریشه، غلظت کربوهیدرات ریشه و ساقه همچنین غلظت  ﭘروتئین دانه های  گیاه سسبانیا در تنش خشکی انجام شد.

مواد وروش ها:

به منظور مطالعه تاثیرات همزیستی قارچ میکوریزا روی جذب عناصر نیتروژن و فسفر ریشه ،فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز ریشه،غلظت پرولین ریشه وبرگ، محتوای پروتئین دانه وغلظت کربوهیدرات ساقه وبرگ گیاه سسبانیا اکولیتا تحت تنش کم آبی، این آزمایش به صورت طرح بلوک کامل تصادفی در مکان (سطوح تنش کم آبی به عنوان مکان در نظر گرفته شدند) در گلخانه مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گرگان اجرا شد. پس از تعیین نیاز آبی خاک، تیمارهای آزمایش، سه سطح تنش کم آبی و دو سطح تلقیح قارچ مایکوریزا بود. تنش های کم آبی در حوضچه های لایسیمتری با آبیاری دو روز درمیان ( آبیاری مطلوب،  S0)، چهار روز درمیان ( تنش آبی متوسط ، S1) و شش روز درمیان( تنش آبی شدید، S2 ) اعمال شد. قارچ میکوریزایی تلقیح شده، Glomus intradensis بود. در مراحل مختلف گلدهی و پرشدن دانه، از ریشه ،برگ ،ساقه و دانه جهت انجام آزمایشات ، نمونه گیری صورت گرفت. سنجش نیترات ردوکتاز ریشه مطابق روش Sym (1984)  انجام شد.به این ترتیب که 5/0 گرم نمونه ریشه، در لوله آزمایش حاوی محلول انکوباسیون (پروپانول 3% حجمی و تامپون فسفات 100 میلی مولار ) قرار داده شد. پس از بستن دهانه لوله با درب پلاستیکی، نمونه ها به مدت 1 ساعت در آون با دمای 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از صاف کردن، بلافاصله 2 میلی لیتر از محلول بالا برداشته و به ترتیب 1 میلی لیتر گریس I (حل کردن 5/0 گرم اسید سولفانیلیک در اسید استیک 50 درصد) و گریسII (حل کردن 2/0 آلفا نفتیل آمین در اسید استیک 50 درصد) اضافه شد و در نهایت جذب آن در 520 نانومتر خوانده شد. پس از ترسیم منحنی استاندارد معادله خط تعیین و سپس مقدار نیتریت تولید شده به ازای هر گرم وزن تر ماده (M) محاسبه شد. برای سنجش محتویات پروتئین دانه ها از روش Lawry و همکاران(1951) استفاده شد . بعد از تهیه نمونه های خشک، همگن سازى نمونه ها در بافر تریس -اسید کلریدریک صورت گرفت. نمونه ها سانتریفیوژشدند بعد از برداشتن 05/0سی سی از محلول بالایی، یک میلی لیتر معرف D به نمونه ها افزوده شد، 3 میلی لیتر معرفE ( فولین ) اضافه شد  بعداز قرار گرفتن در بن ماری در دمای 50درجه به مدت 15 دقیقه، جذب نوری آنها در طول موج  625 نانومتر خوانده شد سپس بااستفاده ازمنحنی استاندارد میزان پروتئن دانه مشخص شد. در این آزمایش  معرف D ترکیبی ازمعرف) Aکربنات سدیم و سود 5/0 نرمال)، معرف B (سولفات مس یک درصد) و معرف C (تارتارات سدیم وﭘتاسیم 2 درصد) بود.برای سنجش محتویات نیتروژن  بعد از هضم شدن نمونه ها در بالن ژوژه با اسید سولفوریک ،اسید سالیسیلیک و آب اکسیژنه از روش کجل تک اتوآنالیزر استفاده شد. جهت تعیین درصد  فسفر در ریشه از روش Chapman و ) Pratt1961 ) استفاده شد. ابتدا نمونه های خشک گیاهی در بالن ژوژه با اسید سولفوریک، اسید سالیسیلیک و آب اکسیژنه هضم شدند ﭘس از تهیه عصاره ، معرف وانادات – مولیبدات به نمونه اضافه گردید و ﭘس از رساندن حجم نمونه به 50 میلی لیتر شدت جذب نور توسط محلول ها در nm470 به وسیله اﺳﭙکتروفتومتر اندازه گرفته شد. با استفاده از منحنی استاندارد میزان فسفر موجود در بافتهای گیاهی محاسبه گردید. برای سنجش پرولین از روش Bates وهمکاران (1973)استفاده شد ابتدا 5/0 گرم از نمونه تر در 10سی سی محلول 3 درصد اسید سالفوسالسیلیک ساییده شد، بعد از صاف کردن محلول، دو سی سی از محلول برداشته و به آن2 سی سی معرف نینهیدرین و2 سی سی اسید استیک خالص اضافه شد، بعد از قرار دادن نمونه ها در بن ماری در دمای 100درجه به مدت یک ساعت آنگاه 5/0 ساعت در حمام یخ قرار گرفتند سپس 4 سی سی تولوئن به نمونه ها اضافه شده بعد از تکان دادن در طول موج 520 نانومتر، جذب لایه رنگی فوقانی خوانده شد. سپس با استفاده از منحنی استاندارد غلظت پرولین مشخص شد. برای سنجش کربوهیدرات از روش Nandi و همکاران(2001) استفاده شد. ابتدایک گرم نمونه خشک در ده سی سی الکل 70درصد به مدت یک هفته در دمای چهار درجه قرار گرفت. بعد از صاف کردن و هموژن کردن نمونه ها در ده سی سی آب مقطر، آنگاه در بن ماری 100درجه به آنهاحرارت داده شد. بعد از سانتریفیوژ و جداسازی عصاره آبی، به 5/0 سی سی از عصاره آبی ،نیم سی سی الکل ،نیم سی سی آب، یک سی سی فنل وپنج سی سی اسید سولفوریک غلیظ به نمونه ها اضافه شد. سپس جذب نوری آنها در 470 نانومتر خوانده شد. بعد از رسم منحنی استاندارد، غلظت قند های محلول مشخص شد. درنهایت داده های به دست آمده بر اساس طرح آماری و با استفاده از نرم افزارهای SAS و مقایسه میانگین ها با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد تجزیه و تحلیل شدند.

نتایج و بحث:

همانطور که در شکل 1- الف نشان داده شده است در برهم کنش آبی با میکوریزا مقادیر فسفر گیاه تغییر معنی داری نداشته است. شیرانی و همکاران ( 1379) در تحقیقات خود بر روی گیاه ذرت گزارش دادند همزیستی میکوریزایی سبب افزایش معنی دار فسفر می شود.Body  و همکاران (1989) بیان کردند افزایش جذب فسفات توسط ریشه های میکوریزی به علت توسعه هیف های خارجی قارچ در خاک و در داخل بافت های ریشه می باشد، Reid و Bowen (1979) گزارش کردند قارچ میکوریزا از طریق انشعابات میسیلیومی و ریسه ای خود سبب توسعه ریشه گیاه شده و از این طریق باعث استفاده ریشه گیاه از ریزوسفر بیشتر شده است از طرف دیگر Tarafdar and Marschner (1995)، بیان کردند قارچ میکوریز با تولید آنزیم فسفاتاز سبب تجزیه فسفات های آلی و پیرو فسفات های غیر آلی شده و به ترتیب موجب فراهم کردن فسفر غیر قابل جذب برای گیاه گردیده است بنابراین باعث افزایش جذب فسفر و بالا رفتن مقدار فسفر کل گیاه شده است، Reid and Bowen (1979) گزارش دادند همزیستی میکوریزا حتی در تنش شدید نیز سبب افزایش غلظت فسفر نسبت به تیمارهای بدون تلقیح  می شود زیرا در تنش خشکی شدید نیز  انشعابات میسیلیومی این میکروارگانیسم قادرند به درون خاک و منافذی که برای ریشه و تارهای کشنده گیاه قابل دسترس نیستند راه یابند و بدین ترتیب حجم بیشتری از خاک را مورد استفاده قرار داده و نقش مهمی را در جذب وانتقال آب و عناصر ایفا کنند که این یافته ها با نتایج ما مطابقت نداشت. شکل 1- ب نشان می دهد در برهم کنش کم آبی با میکوریزا مقادیر نیتروژن ریشه گیاه در سطح 1 درصد تغییر معنی داری داشت(جدول2). محمودی وهمکاران (1382)، گزارش دادند که همزیستی میکوریزی، غلظت نیتروژن موجود در اندام هوایی گیاه ﭘسته را افزایش داد. گیاهان پسته پرورش یافته در فسفر نسبتاً زیاد، نیتروژن بیشتری در ریشه و اندام هوایی خود داشتند در صورتی که غلظت نیتروژن در این بخش ها تحت شرایط فسفر کم ، پایین تر بود. Oliver و همکاران (1983) ، دریافتند در شرایط کمبود فسفر گیاهان میکوریزی توانایی بیشتری برای احیاء نیترات از طریق نیترات ردوکتاز نسبت به گیاهان بدون میکوریزی دارند.افزایش فعالیت نیترات ردوکتاز به بهبود تغذیه فسفری ناشی از آغشتگی میکوریزا نیز نسبت داده شده است. بنابراین کمبود فسفر می تواند مانع از احیاء نیترات شود . شیرانی راد وهمکاران ( 1379)، در تحقیقات خود بر روی گیاه ذرت به این نتیجه رسیدند که بین کاربرد و عدم کاربرد میکوریزا در کارایی جذب نیتروژن تفاوت معنی داری وجود ندارد. Robert (2001) ، گزارش داد که همزیستی با میکوریزا در تنش خشکی بر میزان نیتروژن گیاهان تاثیر کمی دارد و این یافته ها با نتایج ما مطابقت داشت. مطابق شکل 2الف، تلقیح قارچ میکوریزایی در ریشه سبب شد فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز، افزایشی حدود 11/0درصد نسبت به ریشه گیاهان بدون تلقیح در سطوح آبیاری مطلوب نشان دهد(جدول2). در تنش خشکی متوسط و شدید، فعالیت این آنزیم بین تیمارهای تلقیح شده و بدون تلقیح، اختلاف معنی داری نداشت. Stewart و Cliquet (1993) ، گزارش دادند که فعالیت نیترات ردوکتاز و گلوتامین سنتتاز در ریشه ها و اندام هوایی گیاهان ذرت بدنبال آغشته شدن با Glomus fasciculatum افزایش می یابد. همچنینSubramanian  و(1998) Charest ، نشان دادند که با کلونیزاسیون میکوریزا در ذرت، فعالیت آنزیم های کلیدی موثر در احیاء نیترات مانند نیترات ردوکتاز ،گلوتامین سنتتاز و گلوتامات سنتتاز به ویژه در شرایط خشکی تحریک می شود. پژوهش های متعددی دلالت بر پاسخ های متفاوت آنزیم نیترات ردوکتاز همراه با تغییر شرایط محیطی موجود است ((Werner ,1995,Huber, 1998. برای نمونه فعالیت این آنزیم در برگ به تغییرات وضعیت آبی حساس بوده و زمانی که پتانسیل آبی کاهش می یابد، فعالیت آنزیم نیز مهار می شود (Christine et al,1998; Huber et al,1998; Tejo and Diaz,1987 ). به نظر برخی محققان این کاهش ناشی از میزان سنتز این آنزیم است . در توجیه بی معنی بودن فعالیت نیترات ردوکتاز بین تیمارهای تلقیح شده با میکوریزا و بدون تلقیح در سطوح تنش خشکی متوسط و شدید می توان گفت چون میزان جذب فسفر در ریشه آنها اختلاف معنی داری نداشت، بنابراین کمبود جذب فسفر در تنش خشکی می تواند مانع از فعالیت نیترات ردوکتاز شده باشد.Oliver و همکاران (1983) نیز افزایش فعالیت نیترات ردوکتاز در گیاهان همزیست را به بهبود تغذیه فسفری ناشی از آغشتگی میکوریزا نسبت داده اند ولی در شرایط آبیاری مطلوب می توان گفت  به دلیل آنکه همزیستی با میکوریزا سبب افزایش جذب آهن می شود(2004 ، Ghazi) و چون نیترات ردوکتاز در ساختار خود نیاز به یون آهن دارد (,et al,1989 Vaucheret) بنابراین شاید بتوان گفت که افزایش جذب یون آهن سبب افزایش فعالیت این آنزیم در تیمارهای همزیست و در شرایط آبیاری مطلوب شد. همانطور که در شکل 2- ب  نشان داده شده است تلقیح میکوریزایی سبب افزایش 4درصدی ذخایر پروتئین دانه در سطح آبیاری مطلوب شد ولی در تنش خشکی متوسط و شدید، بین تیمارهای همزیست و غیر همزیست  از نظر این صفت اختلاف معنی داری وجود نداشت.  در توجیه افزایش پروتئین دانه در تیمارهای تلقیح شده با میکوریزا و در شرایط آبیاری مطلوب، می توان گفت به دلیل آنکه فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز در ریشه گیاه سسبانیا بدنبال آغشته شدن با میکوریزا افزایش یافت. بنابراین سرعت جا به جایی نیترات و آمونیوم خاک در آنها افزایش می یابد( Douds et al, 2000 ). اهمیت اندوختن آمونیوم ونیترات در گیاهان این است که توسط گلوتامین سنتتاز و نیترات ردوکتاز به اسید امینه تبدیل می شودBritto and kronzucker, 2002 ) ). در شرایط تنش خشکی متوسط و شدید در مرحله رسیدگی، چون فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز بین تیمارهای تلقیح شده و بدون تلقیح اختلاف معنی داری مشاهده نشد، بنابراین میزان پروتئین دانه نیز در آنها اختلاف معنی داری نداشت. Robert در (2001) گزارش داد که همزیستی با میکوریزا در تنش خشکی، میزان پروتیین کل گیاهان را افزایش می دهد که با نتایج ما مطابقت نداشت. همانطور که در شکل های 3- الف و ب   مشخص است ،غلظت پرولین ریشه در اثر متقابل دوره های زمانی مختلف آبیاری و سطوح تلقیح مایکوریزایی، در مراحل رویشی، گلدهی و پرشدن دانه اختلاف معنی داری در سطح 1 درصد داشت ( جدول1). با افزایش تنش، غلظت پرولین در همه مراحل نمونه برداری افزایش یافت در مراحل رویشی و گلدهی( شکل3-الف و 3- ب ) غلظت پرولین در تیمارهای تلقیح شده نسبت به تیمارهای بدون تلقیح بیشتر بود. در توجیه افزایش بیشتر پرولین در تیمارهای تلقیح شده در مراحل رویشی و گلدهی می توان اشاره کرد این گیاهان توانایی اسمولتیکی بیشتری برای سازگاری با تنش آب دارند گیاهان با افزایش پرولین ، فشار اسمزی شیره سلولی بافت های خود را تغییر می دهند. تا با اثر تنش مقابله کنند.  لازم به ذکر است پرولین علاوه بر اینکه ، به عنوان یک محلول سازگار که باعث افزایش پتانسیل آب گیاه می باشد بیوسنتز آن می تواند باعث کاهش اکسیداسیون سلولی و تولید مجددNADP لازم برای فرایندهای فتوسنتزی و تنفسی شود. پرولین همچنین می تواند به عنوان منبعی از کربن و نیتروژن در شرایط تنشی برای گیاه محسوب شود(خواجوی،1386). در توجیه کاهش میزان پرولین در تیمارهای تلقیح شده نسبت به تیمارهای تلقیح نشده در مرحله پرشدن دانه(شکل 3ب) می توان اشاره کرد این گیاهان در این مرحله با موفقیت بیشتری از خشکی اجتناب می کنند و بنابراین احتیاج کمتری دارند تا از نظر اسمولتیکی سیمپلاست یا آنزیم های حمایت کننده اسمزی را تنظیم کنند ((Ruiz-Lozano ,2003 ممکن است در این مرحله سایرمحلول های سازگار مانند گلایسین بتائین و یا کربوهیدرات در گیاهان تلقیح شده تجمع کرده باشدو یا پرولین در این مرحله برای ساخت پروتئین دانه مصرف شده باشد. شکل های 4- الف  و ب نشان دادند بین غلظت قندهای محلول در برگ و ساقه تیمارهای تلقیح شده با میکوریزا و بدون تلقیح در مرحله گلدهی ، اختلاف معنی داری در سطح 5 درصد وجودداشت، غلظت قند در هردو شکل در تیمارهای تلقیح شده بیشتر بوداین امر رامی توان این طور توجیه کرد گیاهان تلقیح شده با میکوریزا، بیشتر فتوسنتز انجام می دهند Robert در (2001) بیان کرد که همزیستی با میکوریزا تعداد واحد های فتوسنتزی را افزایش می دهد همچنین در گیاهان آکاسیاو رز تلقیح شده با میکوریزا طول برگ بیشتری می باشد این گیاهان همزیست با سرعت بیشتری پژمردگی برگ ها را بهبود می بخشند.در شکل 4-الف غلظت قند در تنش کم آبی شدید در تیماربدون تلقیح بیشتر بود اما معنی دار نبود.در توجیه این مطلب  Schellenbaum و همکاران (1998) پیشنهاد دادند که  وقتی فتوسنتز محدود انجام شود قارچ ها رقیب قوی برای اختصاص یافتن کربن به ریشه هستند قارچ ها برای انتقال آمونیوم به ریشه و باکتروئیدگرهک ریشه برای تثبیت ازت، نیاز به اسکلت کربنی دارند.در گرهک ها ساکارز اول بوسیله اینورتاز هیدرولیز می شوند. کمبود آب به شدت فعالیت اینورتاز را کاهش می دهد،  این عمل می تواند تجمع کربوهیدرات محلول ریشه ،درطول تنش آب را توجیه نماید. بنابراین میزان صادرات قند های محلول بوسیله قارچ وزیکولار آربوسکولار مایکوریزا به ریشه افزایش پیدا می کنند(Wang eta,1989). شکل 4ب نیز نشان می دهد مقدار زیادی از قندها به ساقه انتقال یافتند  تا بتوانند به ریشه رفته و غذای قارچ را در شرایط تنش تامین کنند و یا می توان گفت قند ها برای استفاده در مرحله پرشدن دانه در ساقه انباشته شدند.

اشکال و جداول