اثر محلول پاشی عصاره گلرنگ بر فعالیت گوایکول پراکسیداز و نشت پذیری غشا سلولی ماشک گل خوشه ای

مقدمه

هرچند که استفاده از علف کش های شیمیایی به عنوان یک روش کلیدی در کنترل علف های هرز محسوب می شوند اما مشکلاتی مانند اثر سو مواد شیمیایی بر محیط زیست و افزایش گونه های علف هرز مقاوم به سموم شیمیایی از پیامدهای استفاده از این ترکیبات می باشد. برای جلوگیری از گسترش مقاومت علفهای هرز و همچنین کاهش مشکلات زیست محیطی ایجاد شده در اثر مصرف علف کشها و نیز کم کردن
هزینه های تولید باید از استراتژی جایگزین مانند استفاده از روش های بیولوژیک و زراعی در کنار
روش های شیمیایی استفاده کرد. یکی از این روش های بیولوژیک استفاده از خاصیت دگرآسیب یک گیاه علیه گیاهی دیگر (علف های هرز) است. تحقیقات اصغری و تواری (1) بیانگر کاهش رشد گیاهچه خردل وحشی تحت تاثیر عصاره آبی جو بود. در همین حال تحقیقات لبافی حسین آبادی و همکاران (4) نشان داد که رشد گیاهچه یولاف وحشی و ماشک گل خوشه ای تحت تاثیر بذر گندم در حال جوانه زنی کاهش یافت.

 شناسایی مکانیزم­های عمل مواد دگرآسِیب در گیاهان می تواند نقش مهمی در معرفی، تولید و استفاده از این مواد به صورت عملی داشته باشد. یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده خسارت ناشی از ترکیبات آللوپاتی در گیاهان، تولید انواع رادیکال‌های آزاد اکسیژن است (3). کلروپلاست و میتوکندری که دو محل عمده حضور چرخه‌های انتقال الکترون در سلول‌های گیاهی می‌باشند همواره در معرض خطر تولید گونه‌های فعال اکسیژن قرار دارند. حضور گونه‌های فعال اکسیژن در محیط سلولی، سبب تخریب  ماکروملکول‌های عمده‌ سلولی نظیر RNA،  DNA و آنزیم‌های حیاتی می‌شود که این خسارت را خسارت اکسایشی گویند  (8).  همچنین یکی از اثرات بارز رادیکال­های آزاد اکسیژن بر سلامت سلول ها تخریب غشاهای سلولی است. بررسی غلظت مالون دی آلدهید بافت گیاهی می تواند بیانگر میزان تخریب غشا سلولی باشد زیرا این ترکیب تحت تاثیر تخریب و پراکسیده شدن غشا  سلولی آزاد می شود (9). Yogatek و همکاران (14) گزارش نمودند که عصاره آفتابگردان سبب کاهش معنی دار جوانه زنی و رشد گیاهچه خردل وحشی شد. ایشان دلیل اصلی کاهش رشد گیاهچه خردل وحشی را تخریب غشا  سلولی آن تحت تاثیر عصاره آبی آفتابگردان بیان نمودند. تحقیقات Yuو همکاران (12) نشان داد که رشد گیاهچه های خیار تحت تاثیر ترکیبات آللوپاتیک کاهش یافت. ایشان همبستگی مثبتی میان کاهش رشد گیاهچه خیار تحت شرایط حضور ترکیبات دگرآسیب با تخریب و پراکسیده شدن غشاهای سلولی خیار مشاهده کردند. در همین حال فرهودی و همکاران (3) کاهش رشد  خردل وحشی تحت تاثیر عصاره آبی آفتابگردان را ناشی از کاهش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانت کاتالاز و در نتیجه تخریب غشا سلولی در گیاهچه خردل وحشی عنوان نمودند. 

این تحقیق به منظور بررسی پتانسیل دگرآسیبی عصاره گلرنگ بر رشد گیاهچه ماشک گل خوشه ای و همچنین بررسی نقش فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز در پاسخ ماشک گل خوشه ای به اثرات دگرآسیبی عصاره گلرنگ انجام شد.

مواد و روش

این آزمایش به منظور بررسی تاثیر محلول پاشی عصاره آبی گلرنگ (Carthamus tintorius)  بر رشد گیاهچه ماشک گل خوشه ای( (Vicia villosa در دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شوشتر انجام شد. به منظور تهیه عصاره آبی 5، 10 و 15 درصد گلرنگ، به ترتیب5، 10 و 15 گرم پودر خشک اندام هوایی گلرنگ در 100 میلی لیتر آب مقطر ریخته شد. پس از 24 ساعت نمونه ها به دستگاه شیکر با دور 120 دور در دقیقه به مدت 12 ساعت منتقل شد.  در تیمار شاهد ماشک گل خوشه ای توسط آب مقطر محلول پاشی شد. جهت رشد گیاه ماشک گل خوشه ای  5 عدد بذر این گیاه در گلدان های پلاستیکی حاوی ترکیب خاک رس و کود پوسیده حیوانی کاشته شد. پس از استقرار گیاهچه ها تعداد آنها به دو عدد در هر گلدان  تنک شد. دو هفته پس از سبز شدن بذور ماشک گل خوشه ای محلول پاشی آنها توسط عصاره آبی گلرنگ طی دو روز پشت سر هم انجام شد. یک هفته پس از محلول پاشی عصاره آبی گلرنگ گیاهچه های ماشک گل خوشه ای جهت بررسی صفات برداشت شد.  در این آزمایش وزن خشک اندام هوایی،  فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز، نشت پذیری غشا سلولی گیاهچه و غلظت مالون دی آلدهید  در برگ ماشک گل خوشه ای مورد بررسی قرار گرفت .

به منظور تعیین غلظت مالون‌دی آلدهید در برگ، ابتدا 3/0 گرم بافت تازه گیاهچه را در محلول 20 درصد تیوکلرواستیک اسید^[1] (TCA) که حاوی 5/0 درصد تیو باربیتوریک اسید[2] است کاملا پودر کرده و سپس این مخلوط به مدت 25 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد در حمام جوش حرارت داده شد. مخلوط را در حمام یخ سرد کرده و طبق روش Valentovicو همکاران(11)  غلظت مالون‌دآلدئید در طول موج 532 نانومتراندازه گیری شد. نشت پذیری غشا سلول بر اساس روش Valentovicو همکاران(11) سنجیده شد. در این روش نیم گرم بافت گیاهچه را پس از شستشو با آب مقطر در 10 میلی لیتر آب مقطر در قوطی های فیلم استریل شده در دمای اتاق به مدت دو ساعت شناور کرده و در پایان دو ساعت، هدایت الکتریکی آب توسط هدایت سنج (مدلInob1) در دمای اتاق سنجیده شد. نمونه ها به انکوباتور با دمای 100 درجه سانتیگراد منتقل شده و به مدت 20 دقیقه در این شرایط قرار گرفتند. پس ازخنک شدن نمونه ها، مجددا هدایت الکتریکی نمونه ها را اندازه گرفته و از معادله 1 نشت پذیری غشا بر حسب درصد اندازه گیری شد:

 (معادله 1)                                                   ×100 (E1/E2)=  نشت پذیری غشا سلولی

    E1: هدایت الکتریکی آب قبل از اتوکلاو

E2     : هدایت الکتریکی آب بعد از اتوکلاو      

 جهت بررسی فعالیت  آنزیم گوایکول اکسیداز ابتدا پروتئین برگ به روشAgrawal  و همکاران( 6) استخراج شد. برای بررسی فعالیت آنزیم گوایکول 50 میکرولیتر محلول پروتینی  استخراج شده از برگ به مخلوط واکنش شامل یک میلی لیتر بافرفسفات10میلی مولار، نیم میلی لیتر محلول8 میلی مولار گوایکول و نیم میلی لیتر محلول 75/2میلی مولار پراکسیدهیدروژن اضافه شد.  پس از اضافه کردن پراکسید هیدروژن بلافاصله افزایش جذب در طول موج 470 نانومتر به مدت 120 ثانیه قرائت شد. فعالیت ویژه آنزیم به صورت مایکرومول تتراگوایکول تشکیل شده در دقیقه در میلی‌گرم پروتئین بیان شد(7).

 محاسبات آماری داده‌های حاصل با استفاده از نرم‌افزار MSTAT-C انجام شد و برای رسم نمودارها از نرم‌افزار EXCEL و برای مقایسۀ میانگین‌ها از آزمون چند دامنه‌ای دانکن (در سطح 5 درصد) استفاده شد.  همبستگی میان صفات مورد نظر با استفاده از نرم افزارSPSS محاسبه شد.

نتایج و بحث

وزن خشک اندام هوایی

وزن خشک اندام هوایی ماشک گل خوشه ای تحت تاثیر غلظت عصاره آبی گلرنگ قرار گرفت (جدول 1). با افزایش غلظت عصاره آبی گلرنگ کاهش وزن خشک اندام هوایی در ماشک گل خوشه ای مشاهده شد (جدول 1). بین وزن  خشک اندام هوایی ماشک گل خوشه ای با نشتی غشا سلولی و غلظت مالون دی آلدهید برگ همبستگی منفی مشاهده شد (جدول 3) که نشان دهنده تاثیر منفی تخریب غشاهای سلولی بر رشد گیاهچه است.  وزن خشک اندام هوایی ماشک گل خوشه ای در غلظت عصاره 15 درصد گلرنگ نسبت به  شاهد حدود 38 درصد کاهش یافت (شکل1). Wu و همکاران (13) نیز کاهش وزن و رشد گیاهچه Lolium rigidum  تحت تاثیر اثرات دگرآسیبی گندم را گزارش کرده­اند. در مطالعات مکی زاده تفتی و همکاران (5) در خصوص اثرات آللوپاتیک گیاه سداب(Ruta graveolens)  بر جوانه زنی بذر سه گونه علف هرز تاج خروس، خاکشیر و خرفه  نیز رشد گیاهچه تاج خروس تحت عصاره گیاه سداب متوقف شد.

نشت پذیری غشا سلولی و غلظت مالون دی آلدهید برگ

نشت پذیری غشا سلولی و غلظت مالون دی آلدهید برگ ماشک گل خوشه ای تحت تاثیر غلظت عصاره آبی گلرنگ قرار گرفت (جدول 1). با افزایش غلظت عصاره آبی گلرنگ افزایش نشتی غشا سلولی  و غلظت مالون دی آلدهید برگ (جدول 2) در ماشک گل خوشه ای دیده شد. افزایش معنی دار نشتی غشا سلولی تنها در سطح عصاره  15درصد گلرنگ دیده شد در حالیکه افزایش معنی دار غلظت مالون دی آلدهید برگ ماشک گل خوشه ای که بیانگر تخریب غشاهای سلولی است در مقایسه با شاهد در سطح عصاره آبی 10 درصد گلرنگ مشاهده گردید. نتایج نشان داد که غلظت 15 درصد عصاره گلرنگ بیش از 50 درصدی نشتی غشا سلولی برگ ماشک گل خوشه ای در مقایسه با شاهد افزایش داد (جدول 2). Farooq و Azam  (8)  به اهمیت بررسی نشتی غشا سلولی در شرایط تنش های محیطی اشاره کرده­اند. نتایج تحقیق حاضر با تحقیقات فرهودی و همکاران (3) نیز مطابقت دارد  که  مشاهده نمودند تخریب غشاهای سلولی خردل وحشی تحت تاثیر ترکیبات دگرآسیب آفتابگردان عامل اصلی کاهش رشد گیاهچه خردل وحشی است. Yu و همکاران (12) نیز گزارش نمودند که  افزودن ترکیبات دگرآسیب به محیط هیدروپونیک رشد خیار سبب تخریب غشاهای سلولی و کاهش رشد گیاهچه­های خیار شد.  در آزمایش حاضر همبستگی منفی میان نشت پذیری غشا سلولی  و وزن خشک اندام هوایی بیانگر تاثیر مخرب ترکیبات آللوپاتیک عصاره گلرنگ بر رشد گیاهچه ماشک گل خوشه ای می باشد.

فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز

فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز در برگ ماشک گل خوشه ای تحت تاثیر غلظت عصاره آبی گلرنگ قرار گرفت (جدول 1). با افزایش غلظت عصاره آبی گلرنگ کاهش فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز در  ماشک گل خوشه ای مشاهده شد (جدول2) بطوریکه کمترین فعالیت این آنزیم تحت تاثیر عصاره 15 درصد گلرنگ مشاهده شد. البته عصاره 5 درصد گلرنگ سبب افزایش فعالیت این آنزیم در گیاهچه ماشک گل خوشه ای شد اما این افزایش معنی دار نبود. با توجه به همبستگی مثبت فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز و وزن خشک اندام هوایی ماشک گل خوشه ای و همبستگی منفی میان فعالیت این آنزیم با غلظت مالون دی آلدهید برگ و نشتی  غشا سلولی می توان گفت احتمالا کاهش وزن خشک اندام هوایی ماشک گل خوشه ای  ناشی از کاهش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانت گوایکول پراکسیداز و تشدید تخریب غشاهای سلولی است. Orzak و همکاران (10) بیان نمودند که تخریب غشای سلولی در گیاهچه های خردل وحشی تحت اثر بقایای آفتابگردان ناشی از کاهش فعالیت آنزیم های گوایکول پراکسیداز و کاتالاز در گیاهچه
خردل وحشی بود. فرهودی و همکاران (3) نیز کاهش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانت کاتالاز را عامل اصلی کاهش رشد گیاهچه های خردل وحشی و پنیرک تحت تاثیر عصاره آبی آفتابگردان بیان نمودند.

 تاثیر منفی ترکیبات آللوپاتیک حاصل از گیاهان مختلف بر رشد گیاهچه در بسیاری از گیاهان گزارش شده است (4، 2، 5، 13). کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت و تخریب غشاهای سلولی تحت تاثیر ترکیبات آللوپاتیک می تواند یکی از دلایل عمده کاهش رشد گیاهچه گیاهان هدف تحت تاثیر حضور مواد آللوپاتیک باشد (3،  12). سلطانی پور و همکاران (2) گزارش کردند که افزایش غلظت اسانس گیاه مورخوش
( Zhumeria majdae ) سبب کاهش میزان فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز و در نتیجه کاهش وزن خشک و محتوی کلروفیل در تره تیزک و سوروف شد. Yogatek و همکاران (14) مشاهده نمودند عصاره آبی آفتابگردان سبب تخریب غشا سلولی گیاهچه خردل وحشی و در نتیجه کاهش رشد گیاهچه  شد. ایشان همبستگی مثبتی میان غلظت مالون دی آلدهید گیاهچه خردل وحشی(اکسیده شدن و تخریب غشا سلولی) با غلظت عصاره آفتابگردان مشاهده نمودند.   با توجه به همبستگی منفی میان نشت پذیری غشا سلولی و غلظت مالون دی آلدهید بافت برگ ماشک گل خوشه ای با  وزن خشک اندام هوایی در این آزمایش (جدول 3) و کاهش فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز تحت تاثیر عصاره آبی گلرنگ (جدول 2) می توان گفت یکی از مکانیسم های آسیب ترکیبات آللوپاتیک در آزمایش حاضر تخریب غشاهای سلولی تحت تاثیر کاهش فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز است.

جدول 1- تجزیه واریانس تاثیر عصاره آبی گلرنگ بر خصوصیات فیزیولوژیک  ماشک گل خوشه ای^*

Ns، ** و *  به ترتیب غیر معنی دار و معنی دار در سطح یک و پنج درصد 

جدول 2- مقایسه میانگین  تاثیر عصاره آبی گلرنگ بر خصوصیات فیزیولوژیک  ماشک گل خوشه ای ^*

*:در هر ستون میانگین هایی که دارای حرف مشترک هستند تفاوت آماری در سطح پنج درصد ندارند

جدول 3- همبستگی میان صفات مورد بررسی در آزمایش تاثیر عصاره آبی گلرنگ بر ماشک گل خوشه ای 

*: معنی دار در سطح پنج درصد        **: معنی دار در سطح یک درصد                 ns:  معنی دار نیست