شناسایی جابجایی کروموزومی 1BL/1RS در ارقام گندم نان

     مقدمه

     بازوی کوتاه کروموزوم شماره یک چاودار (1RS) علاوه بر داشتن ژن­های مقاومت به بیماری­ها و آفات (26،22،7،2) می­تواند باعث افزایش سازگاری، تحمل به تنش آبی¹ و پتانسیل عملکرد در گندم نان نیز شود (27،24،23،16،13،6). متاسفانه حضور بازوی 1RS در گندم می­تواند موجب کاهش کیفیت خمیر و پخت نان گردد (18،17،9،8). Bartos و همکاران (2008) تعداد ژن­های ژنوم چاودار (Secale cereal L., 2n = 2x = 14, RR) و بازوی 1RS آن را بترتیب 36000 و 2000 عدد برآورد کردند.  Sharmaو همکاران (2009 و 2010) نشان دادند که 15٪ انتهایی بازوی کروموزومی 1RS ممکن است حامل ژن­هایی باشند که از طریق تاثیر بر مورفولوژی و آناتومی ریشه موجب سازگاری و بقاء لاین­های واجد 1RS در شرایط تنش آبی گردند. اثر مثبت 1RS در افزایش 3/11 درصدی عملکرد دانه تحت شرایط رطوبت کاهش یافته توسط Villareal و همکاران (1998) گزارش شده بود­. در جابجایی² 1BL.1RS (T1BL.1RS)، با حذف بازوی کوتاه کروموزوم 1B گندم (1BS)، بازوی کروموزومی1RS  چاودار به بازوی بلند کروموزوم 1B گندم (1BL) منتقل می­شود. امروزه T1BL.1RS در ارقام مختلف گندم در سراسر جهان وجود دارد و ظاهرا بخشی از مخزن ژنی گندم گردید بطوریکه تنها در شمال چین 70-50 درصد ارقام زراعی گندم دارای این جابجایی هستند (29).  شناسایی و تعیین منشاء و مقدار کروماتین چاودار در زمینه ژنتیکی گندم با استفاده از روش­های مختلف بیوشیمیایی، سیتوژنتیکی و مولکولی انجام می­گیرد (30،29،21،20،12،11،10،4). وجود T1BL.1RS در بخشی از ژرم پلاسم کشورهای مختلف جهان (29،28،25،21،19،15،14،11) بیانگر اهمیت آن در اصلاح گندم می­باشد.  

منشاء کروماتین 1RS در اغلب ارقام از چاودار پتکوس³ می­باشد (14،22). یرای استفاده موثرتر از 1RS در اصلاح گندم، لازم است تنوعات جدید 1RS از منابع مختلف چاودار  به جابجایی 1BL.1RS وارد گردد ( 28،22،14،13). با توجه به ارتباط ایران با مرکز بین المللی اصلاح گندم و ذرت (سیمیت)⁴ ، احتمالا T1BL.1RSدر ژرم پلاسم گندم نان ایران نیز وجود دارد. اخیرا  Mirzaghaderi و همکاران (2011) با بررسی 33 رقم گندم نان ایرانی نشان دادند که ارقام اترک، دز، فلات و رسول دارای T1BL.1RS هموزیگوس هستند. برای دستیابی به اطلاعات مرتبط با تنوع ژنتیکی و توزیع T1BL.1RS در ژرم پلاسم گندم نیاز به بررسی جامع می­باشد. با این وجود در این تحقیق ضمن بررسی وجود T1BL.1RS در 17 ژنوتیپ گندم نان ایرانی با روش­های ایزوالکتریک فوکوسینگ آنزیم گلوکز فسفات ایزومراز⁵ (IEF-GPI)، نواربندی سی⁶ و هیبریداسیون در مکان فلورسنت⁷ (FISH) ، کارائی روش­های فوق در شناسایی T1BL.1RS  نیز بحث گردید.  

مواد و روش ها

مواد گیاهی در این مطالعه 17 ژنوتیپ گندم هگزاپلوئید (روشن، البرز، آتیلا، سرداری، زاگرس، کراس سرخ تخم، سبلان، فلات، بولانی، قدس، اینیاء 66، ماهوتی یزد، مارون، توباری، شعله، تجن و کارچیا) بررسی شدند. ارقام بهاره چینی دارای T1BL.1RS و    سری- 82  فاقد T1BL.1RS بعنوان شاهد استفاده شدند. کلیه بذرها از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال بذر کرج تهیه گردیدند.

روش سیتولوژیکی شمارش کروموزوم­های متافاز میتوز همه ارقام با روشMujeeb-Kazi  و Miranda (1985) انجام شد که مراحل آن بترتیب عبارت بودند از: جوانه­دار کردن بذور، تیمار ریشه­ها با محلول پیش تیمار (حاوی کلشی­سین 005/0 درصد، 8- هیدروکسی کینولین 025/0 درصد و چند قطره از دی متیل سولفوکساید) به مدت 5/3 – 3 ساعت در دمای اتاق، تثبیت و رنگ­آمیزی ریشه­ها با استئواورسئین 2% در  °C4 بمدت سه روز، گرم کردن یکی از ریشه­ها­ در اسید استیک 45%  و گرفتن اسید اضافی با کاغذ صافی، قرار دادن ریشه روی یک لام میکروسکوپی تمیز، برش انتهای نوک ریشه و تخلیه محتویات آن در زیر استرئومیکروسکوپ، افزودن یک قطره اسید استیک 45%  روی محتویات ریشه و گذاشتن لامل، حرارت دادن ملایم، قرار دادن اسلاید بین کاغذ صافی و فشار دادن ملایم با انگشت شصت، مشاهده با میکروسکوپ نوری و دائمی کردن اسلایدهای مناسب. مراحل دائمی کردن اسلاید بترتیب عبارت بودند از: قرار دادن اسلاید در °C 80-  بمدت حداقل یک ساعت، برداشتن لامل با تیغ، تیمار اسلاید با الکل مطلق در  °C4 در طول شب و خشک کردن آن در دمای اتاق، تیمار با گزیلن در دمای اتاق بمدت 30- 15 دقیقه و خشک کردن، چسباندن لامل با چسب یوپارل⁸ (20،3).

      در بررسی­های سیتولوژیکی، نواربندی سی و FISH حداقل سه گیاه از هر رقم و حداقل سه سلول با کروموزوم­های متافازی خوب به ازاء هر گیاه آنالیز شدند.    

روش نواربندی– سی جوانه­دار کردن بذور، پیش تیمار، تثبیت، رنگ­آمیزی، تهیه اسلاید و برداشتن لامل همانند روش شرح داده شده در قسمت سیتولوژی انجام شد، با این تفاوت که تثبیت و رنگ­آمیزی با استوکارمین 2/0 درصد صورت گرفت. مراحل بعدی بترتیب عبارت بودند از: دو دقیقه تیمار اسلاید­ها با اسید استیک 45%  در °C60، تیمار با اتانول خالص در صفر درجه سانتیگراد در طول شب، دو دقیقه تیمار با اسید کلریدریک 2/0 مولار در °C 60، هشت دقیقه تیمار با هیدروکسید باریوم اشباع شده در دمای اتاق، یک ساعت تیمار با سدیم سالین سیترات با غلظت مضاعف⁹(2X SSC) در °C60، انتقال مستقیم اسلاید­ها به محلول رنگی گیمسا 6% بمدت حداقل 15 دقیقه در دمای اتاق، مشاهده با میکروسکوپ نوری، انتخاب اسلاید­های خوب و دائمی کردن از طریق چسباندن لامل با چسب یوپارل بدون نیاز به تیمار با الکل و گزیلن (20،11،3). با توجه به استفاده مکرر از غلظت­های مختلف محلول  SSC بویژه در روش FISH، بهتر است محلول 20X SSC (محلول SSC که غلظت اجزاء سازنده آن بیست برابر گردید) بعنوان محلول استوک تهیه و سپس محلول­های SSC، 2X SSC و یا 4X SSC از آن ساخته شوند.  

استخراج آنزیم گلوگز فسفات ایزومرازو ایزوالکتریک فوکسینگ مراحل استخراج آنزیم GPI بترتیب عبارت بودند از: پودر کردن هر بذر بطور جداگانه و انتقال آن به اپندورف، افزودن 90 میکرولیتر (µl) از محلول استخراج تریس 1/0 مولار با pH=7.5  به هر اپندورف و 5 دقیقه ورتکس، تکرار مرحله قبل و نگهداری آن در دمای اتاق بمدت 2- 5/0 ساعت بعد از ورتکس نمودن، دو دقیقه سانتریفوژ عصاره بذر با  rpm11500و جداسازی محلول روئی. محلول روئی حاوی آنزیم GPI است که تا زمان آنالیز در °C 20-  نگهداری می­شود (30،5).  

       برای جداسازی ایزوزایم­های آنزیمGPIاز IEF روی ژل پولی آکریلامید نازک با طول و عرض 18 × 6 سانتی­متر دارای آمفولیت باpH=3.5-9.5  استفاده گردید. الکتروفورز با دستگاه مولتی فور انجام شد. 1M NaOH و 1M H₃PO₄ بترتیب بعنوان بافرهای کاتدی و آندی استفاده شدند. جهت آماده سازی شیب pH، پیش فوکوسینگ ژل¹⁰ با توان الکتریکی 15 وات، ولتاژ 1700 ولت و شدت جریان 50 میلی­آمپر در °C 5 بمدت 30 دقیقه انجام شد. سپس با ریختن µl 20 از هر نمونه در چاهک، الکتروفورز  با شرایط بالا بمدت حدود 6 ساعت ادامه یافت. ژل ابتدا 30 دقیقه در روشنایی و سپس یک ساعت در تاریکی در دمای اتاق در محلول رنگ­آمیزی قرار گرفت. اساس رنگ­آمیزی ژل بر پایه احیاء MTT¹¹ و تشکیل فورمازان نامحلول است (30،5). الگوی باندهای GPI هر رقم در چهار تکرار بررسی شد.

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­هیبریداسیون در مکان فلورسنت (FISH) جوانه­دار کردن بذور، پیش تیمار، تثبیت، رنگ­آمیزی و تهیه اسلاید همانند روش شرح داده شده در قسمت سیتولوژی انجام شد، با این تفاوت که ریشه­ها پس از رنگ­آمیزی، با بافر سیترات 01/0 مولار شستشو و سپس با محلول آنزیمی دارای سلولاز 5% ، پکتیناز 2% و بافر سیترات 01/0 مولار در °C 37 بمدت 20 دقیقه  نیز تیمار شدند. اسلاید­های دارای حداقل سه سلول متافازی خوب برای FISH انتخاب ­شدند که مراحل بعدی آن بترتیب عبارت بودند از: قرار دادن اسلاید در °C 80-  در طول شب و سپس خارج کردن لامل با تیغ، 10 دقیقه تیمار با اسید استیک 45%  در دمای اتاق جهت حذف رنگ اضافی، افزودن µl100 از محلول RNase A به هر اسلاید و 45 دقیقه تیمار در °C 37 جهت حذف RNA کروموزومی، 5/2 دقیقه تیمار با فرم آمید70% در °C70 برای واسرشتگی¹² مولکول DNA، آبگیری اسلاید­ها  بترتیب با اتانول سرد 70% ، 90%  و خالص در °C 20- (هر دفعه 4 دقیقه)، تیمار با µl 45 از مخلوط هیبریداسیون: ابتدا 10 دقیقه در °C 80  و سپس در طول شب در °C 37 در اتاقک مرطوب (از DNA چاودار و گندم بهاره چینی بترتیب بعنوان نشانگر و بلوک کننده به نسبت 1 به 10 در مخلوط هیبریداسیون استفاده گردید)، دو بار شستشو با محلول 2X SSC در °C40 (هر دفعه 5 دقیقه)، 10 دقیقه تیمار با فرم آمید 50%  در °C 42 ، دو بار شستشو با محلول 2X SSC در °C40 (هر دفعه 5 دقیقه)، 5 دقیقه شستشو با محلول 2X SSC در دمای اتاق، 5 دقیقه شستشو با بافر آشکارسازی 4X SSC) دارای 2% Tween 20 ( در دمای اتاق، افزودنµl 150 از محلول آلبومین سرم گاوی 5% و 5 دقیقه تیمار در دمای اتاق، یک ساعت تیمار با µl 150 از محلول آویدین فلورسنس در °C 37، سه بار شستشو با بافر آشکارسازی در °C 37 (هر دفعه 6 دقیقه)، افزودن µl 150 از سرم نرمال خرگوش 5% و 5 دقیقه تیمار در دمای اتاق، افزودن µl 150 از محلول

آنتی آویدین بیوتینیله شده و یک ساعت تیمار در  °C37، سه بار شستشو با بافر آشکارسازی در °C 37 (هر دفعه 6 دقیقه)، افزودن µl 150 از محلول فلورسنت دپی¹³(DAPI) و 40 دقیقه تیمار در دمای اتاق در تاریکی، دو دقیقه شستشو با بافر آشکارسازی در دمای اتاق، افزودن µl 150 از محلول پروپیدیوم یدید¹⁴ (PI)و 30 دقیقه تیمار در دمای اتاق در تاریکی، دو دقیقه شستشو با 2X SSC در دمای اتاق، خشک کردن اسلاید و دائمی کردن آن از طریق افزودن 2- 1 قطره از چسب مخصوص فلورسنس بنام وکتاشیلد¹⁵ به هر اسلاید و گذاشتن لامل روی آن (بدون نیاز به تیمار با الکل و گزیلن)، بررسی اسلاید با میکروسکوپ فلورسنت و گرفتن عکس (21،20،10). آزمایش FISH در سیمیت کشور مکزیک انجام شد.

نتایج و بحث

         امروزه تعداد زیادی از ارقام گندم در سراسر جهان حاملT1BL.1RS  می­باشند (29،28،25،21،19،15،14،11). بنابراین شناسایی این جابجایی در ارقام گندم نان ایران از طریق بکارگیری روش­های بیوشیمیایی، سیتولوژیکی و مولکولی و استفاده از آنها در اصلاح گندم مفید بنظر می­رسد. داشتن سلول­های متافازی با توزیع کروموزومی مناسب پیش شرط موفقیت در روش­های نواربندی سی و FISH می­باشد. بنابراین استفاده از شمارش کروموزوم­های متافاز میتوز با روشMujeeb-Kazi  و Miranda (1985) ضمن تائید سطوح پلوئیدی ارقام مورد بررسی (شکل­های 1و2)، نشان داد که می­تواند روشی مطمئن برای بررسی­های نواربندی سی و FISH باشد. در اسلاید­های تهیه شده با این روش می­توان حداقل 10 سلول متافازی با توزیع کروموزوم­های بسیار مناسب مشاهده کرد.

     برای شناسایی سریع وجود کروماتین 1RS، از روش الکتروفورزی IEF-GPI استفاده شد. Chojecki و Gale (1982) نشان دادند که اغلب یاندهای کاتدی زیموگرام GPI عصاره بذر گندم محصول ژن Gpi-B1 است که روی بازوی کوتاه کروموزوم 1B گندم (1BS) قرار دارد. (در متن فوق حروف T، R، B، L و S بترتیب بیانگر جابجایی، کروموزوم چاودار، کروموزوم گندم، بازوی بزرگ و  بازوی کوچک است). ظاهرا در الگوی باندهای GPI گندم نان هموزیگوس فاقد جابجایی (1BL.1BS, 1BL.1BS) و یا گندم نان دارای جابجایی هتروزیگوسی 1BL.1BS,1BL.1RS ) یعنی تنها یکی از دو کروموزوم­ 1B دارای بازوی کروموزومی 1RS است) عموما 10- 9 باند دیده می­شود اما گندم نان دارای جابجایی هموزیگوسی 1BL.1RS, 1BL.1RS) یعنی هر دو کروموزوم همولوگ 1B دارای بازوی کروموزومی 1RS هستند) بعلت حذف کامل بازوی 1BS گندم معمولا 8- 6 باند دارد (21،30).  بنابراین این دو باند حذف شده در انتهای کاتدی می­تواند بعنوان یک نشانگر پروتئینی منفی مهم برای تمایز جابجایی هموزیگوسی از انواع هترزیگوسی یا فاقد جابجایی استفاده شود. نتایج IEF-GPI این مطالعه نشان داد که دو رقم فلات و سبلان همراه با شاهد سری- 82  دارای T1BL.1RS هموزیگوس هستند (شکل 3). بررسی دقیق الگوی باند­های GPI ارقام مورد بررسی نشان داد که هیچگونه چند شکلی در میان آنها وجود ندارد. Chojecki و Gale (1982) با مطالعه زیموگرام GPI در 46 رقم گندم هگزاپلوئید، هیچ تنوع یا چند شکلی در فنوتیپ GPI مشاهده نکردند و اظهار داشتند که سیستم GPI بشدت حفاظت می­شود. Mujeeb-Kazi و Hettle (1995) و همچنین William و همکاران (1992) از این نشانگر پروتئینی برای شناسایی ارقام دارای T1BL.1RS استفاده کردند. آنها عقیده دارند که IEF-GPI روشی سریع، دقیق و اقتصادی است و می­توان از آن برای غربالگری اولیه ژرم پلاسم گندم استفاده کرد. در روش IEF-GPI می توان در هر ژل 48 نمونه را در کمتر از یک روز غربالگری کرد. از طرف دیگر روش فوق غیر تخریبی است یعنی می­توان از نیمه بذر دارای اندوسپرم (فاقد جنین) برای الکتروفورز استفاده کرد و در صورتی که نوع بذر خیلی مهم باشد، می­توان نیمه دیگر آن (واجد جنین) را جوانه­دار کرده و از آن بذر تهیه نمود. همچنین در مواردی که لازم است نتایج الکتروفورز و سیتولوژی از یک بذر باشند، می­توان نیمه بذر فاقد جنین را برای الکتروفورز و ریشه­های حاصل از جوانه دار کردن نیمه دیگر بذر (قسمت جنین  دار بذر) را برای سیتولوژی استفاده کرد. متاسفانه روش فوق قادر به تفکیک ارقام فاقد جابجایی از ارقام دارای جابجایی هتروزیگوسی نیست زیرا هر دو ژنوتیپ دارای حداقل یک بازوی 1BS هستند و بنابراین الگوی باند­های آنها مشابه یکدیگر می­باشد. بعبارت دیگر هر دو ژنوتیپ دارای دو باند نشانگر کاتدی و در مجموع 10- 9 باند هستند. بنابراین همیشه از یک روش مکمل در کنار روش IEF-GPI استفاده می­گردد مثل الکتروفورز ژل پولی آکریلامید گلیادین در محیط اسیدی یا نواربندی سی (30،21).

     در این مطالعه از روش نواربندی سی بعنوان روشی مکمل برای تفکیک ارقام فاقد جابجایی از ارقام دارای جابجایی هتروزیگوسی استفاده شد. وجود دو نشانگر­ هتروکروماتینی­ کاملا متمایز در انتهای تلومری 1RS چاودار (شکل 4) و همچنین وجود نوارهای غالب در نواحی سانترومری و انتهایی کروموزوم 1BL گندم، اساس شناسایی T1BL.1RS با روش نواربندی سی می­باشند (شکل 5). روش نواربندی سی نشان داد که هیچکدام از ارقام مورد بررسی دارای جابجایی هتروزیگوسی نیستند. از طرف دیگر روش فوق وجود T1BL.1RS هموزیگوس در ارقام فلات و سبلان (شکل 5) را تائید کرد. محققان بسیاری از روش نواربندی سی برای شناسایی T1BL.1RS استفاده می­کنند (22،21،14،12،11). نوار بندی سی روشی پر زحمت و وقت گیر است که نیاز به تجربه و تخصص دارد. بنابراین برای ارزیابی تعداد زیادی از ارقام بویژه ژرم پلاسم گندم مناسب نیست. در این روش می­توان در هر دو روز حدود 10 اسلاید کروموزومی تهیه کرد یعنی بررسی حداکثر سه ژنوتیپ.

    از روش FISH برای اطمینان از وجود بازوی کامل 1RS چاودار در زمینه ژنتیکی ارقام فلات و سبلان بصورت همزیگوس و همچنین عدم وجود ناهنجاری­های کروموزومی دیگر استفاده شد. نتایج FISH نشان می­دهد که بازوی 1RS بطور کامل و هموزیگوس در ارقام فلات و سبلان (شکل 6) وجود دارد. از طرف دیگر روش FISH نشان داد که  ناهنجاری­های کروموزومی یا جابجایی کروموزومی غیر از T1BL.1RS در ارقام فوق مشاهده نگردید. اغلب از روش FISH برای تائید روش­های دیگر شناسائی کروماتین 1RSچاودار استفاده می­شود (21،15،14،11،10،1). این روش بسیار دقیق و حساس می­باشد اما امروزه به علت اقتصادی نبودن در برنامه­های غربالگری استفاده نمی­شود.

نه تنها شناسایی جابجایی 1BL.1RS در ژرم پلاسم گندم کشورهای مختلف انجام می­گیرد (2،11،15،19،21،25،28،29) بلکه محققان بعضی از کشورها در صدد غنی سازی تنوع ژنتیکی بازوی 1RS چاودار (از طریق تولید لاین­های جدید با استفاده از منابع متنوع چاودار) هستند (28،22،14،13).  ظاهرا در ایران Mirzaghaderi و همکاران (2011) با بررسی 33 رقم گندم نشان دادند که ارقام اترک، دز، فلات و رسول دارای جابجایی 1BL.1RS هموزیگوس هستند. در مطالعه حاضر نیز دو رقم از 17 رقم دارای جابجایی فوق هستند. بنابراین ممکن است از این ارقام بعنوان منابع ژرم پلاسم مفید برای اصلاح گندم استفاده کرد. 

     در مقایسه سه روش استفاده شده در این تحقیق می­توان گفت که هر روش دارای مزایا و معایبی است اما در مجموع بهترین روش می­تواند FISH باشد اگر هزینه های آن کاهش یابد. در صورت عدم وجود نوترکیبی بین 1BS و 1RS که بسیار نادر است، روش IEF-GPI بعلت سرعت و اقتصادی بودن می­تواند بهترین روش برای ارزیابی اولیه ژرم پلاسم گندم باشد. روش نواربندی سی برای تعداد نمونه­های کم مناسب است و دیگر نیاز به روش مکمل ندارد. بنابراین استفاده از روش IEF-GPI برای شناسایی فراوانی و توزیع جابجایی 1BL.1RS در ژرم پلاسم گندم ایران پیشنهاد می­گردد.

سپاسگزاری

از مسئولین محترم موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج بخاطر تامین مالی این تحقیق تشکر و قدردانی می­گردد.